貴州是我國主要油茶種植省份之一,油茶種植爆發(fā)病蟲害導(dǎo)致產(chǎn)量與質(zhì)量急劇下降,其中軟腐病最為顯著。本文以油茶軟腐病中的粉芽孢桿菌為例,結(jié)合實(shí)時(shí)熒光PCR和巢式PCR技術(shù),檢測油茶軟腐病病原菌。熒光PCR檢測過程為:設(shè)計(jì)反應(yīng)程序與標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定引物濃度、Mg2+濃度,將油茶軟腐病病原菌DNA作模板,通過特異性引物對L1/L2實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增;在克隆質(zhì)粒和病原菌XJ8-3-3懸液兩種模板中,對比實(shí)時(shí)熒光PCR和普通PCR的靈敏度;向健康植株葉片注射軟腐病粉芽孢桿菌懸液,培養(yǎng)5 d后,采集患病油茶植株根部、球莖等部位檢測軟腐病病原菌含量。巢式PCR檢測病原菌過程為:菌株活化放置PDA平板培養(yǎng)兩天并采集病原菌絲;根據(jù)油茶軟腐病的ITS序列和GenBank中,近似種的ITS序列差異設(shè)計(jì)B1與B2兩種特異性引物,經(jīng)過預(yù)變性、變性等步驟完成擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物用于凝膠檢測。檢測結(jié)果如下:(1)兩種模板環(huán)境下,實(shí)時(shí)熒光PCR檢測靈敏度優(yōu)于普通PCR技術(shù)100倍,葉柄組織的根部軟腐病病原菌含量最少;(2)引物B1與B2檢測油茶軟腐病病菌得到405 bp左右的條帶擴(kuò)增產(chǎn)物,測序結(jié)果顯示發(fā)病菌株的堿基序列和粉芽孢桿菌序列吻合。結(jié)果顯示,兩種PCR技術(shù)均可檢測油茶軟腐病病原中的粉芽孢桿菌,為防治油茶軟腐病提供科學(xué)依據(jù)。